Течната хроматографија е главниот метод за тестирање на содржината на секоја компонента и нечистотиите во суровините, меѓупроизводите, препаратите и материјалите за пакување, но многу супстанции немаат стандардни методи на кои треба да се потпрат, па затоа е неизбежно да се развијат нови методи. Во развојот на методите на течна фаза, хроматографската колона е јадрото на течната хроматографија, така што како да се избере соодветна хроматографска колона е од клучно значење. Во оваа статија, авторот ќе објасни како да се избере колона за течна хроматографија од три аспекти: севкупни идеи, размислувања и опсег на примена.
А. Севкупни идеи за избор на колони со течна хроматографија
1. Оценете ги физичките и хемиските својства на аналитот: како што се хемиската структура, растворливоста, стабилноста (како на пример дали е лесно да се оксидира/намалува/хидролизира), киселоста и алкалноста итн., особено хемиската структура е клучот фактор во одредувањето на својствата, како што е конјугирана група има силна ултравиолетова апсорпција и силна флуоресценција;
2. Определете ја целта на анализата: дали се потребни високо одвојување, висока ефикасност на колоната, кратко време на анализа, висока чувствителност, отпорност на висок притисок, долг век на колона, ниска цена итн.;
- Изберете соодветна хроматографска колона: разберете го составот, физичките и хемиските својства на хроматографскиот филер, како што се големината на честичките, големината на порите, толеранцијата на температурата, толеранцијата на pH, адсорпцијата на аналитот итн.
- Размислувања за избор на колони за течна хроматографија
Ова поглавје ќе ги разгледа факторите што треба да се земат предвид при изборот на колона за хроматографија од перспектива на физичките и хемиските својства на самата колона за хроматографија. 2.1 Матрица за полнење
2.1.1 Матрица на силика гел Матрицата за полнење на повеќето колони за течна хроматографија е силика гел. Овој тип на полнење има висока чистота, ниска цена, висока механичка цврстина и лесно се менуваат групи (како што се фенилна врска, амино врзување, цијано поврзување итн.), но pH вредноста и температурниот опсег што ги толерира се ограничени: рН опсегот на повеќето полнила со матрикс на силика гел е од 2 до 8, но опсегот на pH на специјално модифицираните фази поврзани со силика гел може да биде широк од 1,5 до 10, а има и специјално модифицирани фази поврзани со силика гел кои се стабилни при ниска pH вредност, како што е Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, кој е стабилен на pH од 1 до 8; горната температурна граница на матрицата на силика гел е обично 60 ℃, а некои колони за хроматографија можат да толерираат температура од 40 ℃ при висока pH вредност.
2.1.2 Полимерна матрица Полимерните полнила се главно полистирен-дивинилбензен или полиметакрилат. Нивните предности се што можат да толерираат широк опсег на pH - може да се користат во опсег од 1 до 14, а се поотпорни на високи температури (може да достигнат над 80 °C). Во споредба со полнилата C18 на база на силика, овој тип на полнење има посилна хидрофобност, а макропорозниот полимер е многу ефикасен во одвојувањето на примероците како што се протеините. Неговите недостатоци се тоа што ефикасноста на колоната е помала и механичката цврстина е послаба од онаа на полнилата на база на силика. 2.2 Форма на честички
Повеќето модерни HPLC полнила се сферични честички, но понекогаш тие се неправилни честички. Сферичните честички можат да обезбедат помал притисок на колоната, поголема ефикасност на колоната, стабилност и подолг животен век; кога се користат мобилни фази со висок вискозитет (како фосфорна киселина) или кога растворот на примерокот е вискозен, неправилните честички имаат поголема специфична површина, што е попогодно за целосното дејство на двете фази, а цената е релативно ниска. 2.3 Големина на честички
Колку е помала големината на честичките, толку е поголема ефикасноста на колоната и поголемо раздвојување, но полошо е отпорот на висок притисок. Најчесто користена колона е колоната со големина на честички од 5 μm; ако барањето за одвојување е големо, може да се избере филер од 1,5-3 μm, што е погодно за решавање на проблемот со одвојување на некои сложени матрични и повеќекомпонентни примероци. UPLC може да користи полнила од 1,5 μm; Полнилата со големина од 10 μm или поголеми често се користат за полупрепаративни или подготвителни столбови. 2.4 Содржина на јаглерод
Содржината на јаглерод се однесува на пропорцијата на споена фаза на површината на силика гелот, која е поврзана со специфичната површина и покриеноста на споената фаза. Високата содржина на јаглерод обезбедува висок капацитет на колоната и висока резолуција и често се користи за сложени примероци кои бараат големо одвојување, но поради долгото време на интеракција помеѓу двете фази, времето на анализа е долго; хроматографските колони со ниска содржина на јаглерод имаат пократко време на анализа и можат да покажат различни селективности и често се користат за едноставни примероци кои бараат брза анализа и примероци кои бараат услови на висока водена фаза. Општо земено, содржината на јаглерод во C18 се движи од 7% до 19%. 2.5 Големина на порите и специфична површина
Медиумите за адсорпција на HPLC се порозни честички и повеќето интеракции се одвиваат во порите. Затоа, молекулите мора да влезат во порите за да се адсорбираат и одвојат.
Големината на порите и специфичната површина се два комплементарни концепти. Малата големина на порите значи голема специфична површина и обратно. Голема специфична површина може да ја зголеми интеракцијата помеѓу молекулите на примерокот и врзаните фази, да го подобри задржувањето, да го зголеми оптоварувањето на примерокот и капацитетот на колоната и одвојувањето на сложените компоненти. Целосно порозни полнила припаѓаат на овој тип на полнила. За оние со високи барања за одвојување, се препорачува да се изберат полнила со голема специфична површина; мала специфична површина може да го намали задниот притисок, да ја подобри ефикасноста на колоната и да го намали времето на рамнотежа, што е погодно за анализа на градиент. Полнилата со јадро на школка припаѓаат на овој тип на полнила. Со цел да се обезбеди одвојување, се препорачува да се изберат полнила со мала специфична површина за оние со високи барања за ефикасност на анализата. 2.6 Волумен на пора и механичка сила
Волуменот на порите, познат и како „волумен на пора“, се однесува на големината на празниниот волумен по единица честичка. Може добро да ја одрази механичката сила на полнењето. Механичката цврстина на полнила со голем волумен на порите е малку послаба од онаа на полнила со мал волумен на порите. Полнила со волумен на пора помал или еднаков на 1,5 mL/g најчесто се користат за сепарација на HPLC, додека полнилата со волумен на пора поголем од 1,5 mL/g главно се користат за хроматографија со молекуларна ексклузија и хроматографија со низок притисок. 2.7 Стапка на ограничување
Затворањето може да ги намали врвовите на опашката предизвикани од интеракцијата помеѓу соединенијата и изложените силинолни групи (како што е јонското поврзување помеѓу алкалните соединенија и силинолните групи, силите на ван дер Валс и водородните врски помеѓу киселинските соединенија и силинолните групи), со што се подобрува ефикасноста на колоната и обликот на врвот . Фазите што не се споени со капак ќе произведат различни селективности во однос на фазите со капаче врзани, особено за поларни примероци.
- Опсег на примена на различни колони за течна хроматографија
Ова поглавје ќе го опише опсегот на примена на различни типови колони со течна хроматографија низ некои случаи.
3.1 Хроматографска колона C18 со обратна фаза
Колоната C18 е најчесто користената колона со обратна фаза, која може да ги исполни тестовите за содржината и нечистотијата на повеќето органски супстанции и е применлива за среднополарни, слабо поларни и неполарни супстанции. Видот и спецификацијата на C18 хроматографската колона треба да се изберат според специфичните барања за сепарација. На пример, за супстанции со високи барања за одвојување, често се користат спецификации 5 μm*4,6 mm*250 mm; за супстанции со сложени матрици за раздвојување и сличен поларитет, може да се користат спецификации 4 μm*4,6 mm*250 mm или помали големини на честички. На пример, авторот користел колона од 3 μm*4,6 mm*250 mm за да открие две генотоксични нечистотии во celecoxib API. Раздвојувањето на двете супстанции може да достигне 2,9, што е одлично. Дополнително, под премисата да се обезбеди одвојување, доколку е потребна брза анализа, често се избира кратка колона од 10 mm или 15 mm. На пример, кога авторот користел LC-MS/MS за да открие генотоксична нечистотија во API на пиперакин фосфат, користена е колона од 3 μm*2,1 mm*100 mm. Раздвојувањето помеѓу нечистотијата и главната компонента беше 2,0, а откривањето на примерокот може да се заврши за 5 минути. 3.2 Фенилна колона со обратна фаза
Фенилната колона е исто така еден вид колона со обратна фаза. Овој тип на колони има силна селективност за ароматични соединенија. Ако одговорот на ароматичните соединенија измерен со обична колона C18 е слаб, можете да размислите за замена на фенилната колона. На пример, кога правев celecoxib API, одговорот на главната компонента измерен со фенилната колона на истиот производител и истата спецификација (сите 5 μm*4,6 mm*250 mm) беше околу 7 пати поголем од оној на колоната C18. 3.3 Колона со нормална фаза
Како ефикасен додаток на колоната со обратна фаза, колоната со нормална фаза е погодна за високополарни соединенија. Ако врвот е сè уште многу брз при елуирање со повеќе од 90% водена фаза во колоната со обратна фаза, па дури и блиску и се преклопува со врвот на растворувачот, можете да размислите за замена на колоната со нормална фаза. Овој тип на колона вклучува хилик колона, амино колона, цијано колона итн.
3.3.1 Хилична колона Хилична колона обично вградува хидрофилни групи во врзаниот алкилен ланец за да го подобри одговорот на поларните супстанции. Овој тип на колона е погоден за анализа на шеќерни супстанции. Авторот го користел овој тип на колона кога ја правел содржината и сродните супстанции на ксилозата и нејзините деривати. Изомерите на дериват на ксилоза, исто така, можат добро да се одвојат;
3.3.2. за одвојување на шеќери, аминокиселини, бази и амиди; цијано колоната има подобра селективност при одвојување хидрогенизирани и нехидрогенизирани структурни слични супстанции поради присуството на конјугирани врски. Амино колона и цијано колона често може да се префрлаат помеѓу колона од нормална фаза и колона од обратна фаза, но честото префрлување не се препорачува. 3.4 Хирална колона
Хиралната колона, како што сугерира името, е погодна за одвојување и анализа на хирални соединенија, особено во областа на фармацевтските производи. Овој тип на колони може да се земе предвид кога конвенционалните колони за обратна и нормална фаза не можат да постигнат раздвојување на изомерите. На пример, авторот користел хирална колона од 5 μm*4,6 mm*250 mm за да ги одвои двата изомери на 1,2-дифенилетилендиамин: (1S, 2S)-1, 2-дифенилетилендиамин и (1R, 2R)-1, 2 -дифенилетилендиамин, а одвојувањето помеѓу двете достигна околу 2,0. Сепак, хиралните столбови се поскапи од другите типови на столбови, обично 1W+/парче. Доколку има потреба од такви колони, единицата треба да направи доволен буџет. 3.5 Колона за размена на јони
Колоните за јонска размена се погодни за одвојување и анализа на наелектризирани јони, како што се јони, протеини, нуклеински киселини и некои шеќерни супстанции. Според типот на полнење, тие се поделени на колони за размена на катјони, колони за размена на анјони и колони за силна размена на катјони.
Колоните за размена на катјони вклучуваат колони базирани на калциум и водород, кои главно се погодни за анализа на катјонски супстанции како што се амино киселините. На пример, авторот користел колони базирани на калциум кога анализирал калциум глуконат и калциум ацетат во раствор за испирање. Двете супстанции имаа силни реакции на λ=210nm, а степенот на раздвојување достигна 3,0; авторот користел колумни базирани на водород при анализа на супстанции поврзани со гликоза. Неколку главни поврзани супстанции - малтоза, малтотриоза и фруктоза - имаа висока чувствителност под диференцијални детектори, со ограничување на откривање дури 0,5 ppm и степен на раздвојување од 2,0-2,5.
Колоните за размена на анјони се главно погодни за анализа на анјонски супстанции како што се органски киселини и халогени јони; колоните за силна катјонска размена имаат поголем капацитет и селективност за размена на јони и се погодни за одвојување и анализа на сложени примероци.
Горенаведеното е само вовед во типовите и опсегот на примена на неколку вообичаени колони со течна хроматографија во комбинација со сопственото искуство на авторот. Постојат и други специјални типови на хроматографски столбови во реалните апликации, како што се хроматографски столбови со големи пори, хроматографски столбови со мали пори, колони со афинитетна хроматографија, мултимодни хроматографски колони, колони со течна хроматографија со ултра високи перформанси (UHPLC), суперкритична течна колона (хроматографија SFC), итн. Тие играат важна улога во различни области. Специфичниот тип на хроматографска колона треба да се избере според структурата и својствата на примерокот, барањата за сепарација и други цели.
Време на објавување: Јуни-14-2024 година